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动物源性食品中细菌的检测——布鲁氏菌

日期:07-04 作者:曲志娜,赵思俊等- 小 + 大

(5)尿素酶试验 在尿素细菌鉴定管中接种细菌,12~24h后观察颜色变化。尿素培养基变为红色为阳性反应,培养基颜色不变者为阴性反应。
(6)氧化酶试验 在白色洁净的滤纸上蘸取菌落少许,滴加1%四甲基对苯二胺水溶液,呈现玫瑰红色或深紫色为阳性反应,未出现颜色变化的为阴性反应。
(7)触酶试验 在灭菌的平皿上加数滴3%过氧化氢,挑取细菌并涂布在过氧化氢中,观察变化。有大量气泡产生为阳性反应,不产生气泡为阴性反应。
(8)吲哚试验 UIM培养管中先加1mL乙醚,充分振荡再沿管壁缓慢加入对位二甲氨基苯甲醛5~10滴,观察颜色变化。在培养物与试剂交接面上,呈红色者为吲哚试验阳性反应,无变化者为吲哚试验阴性反应。
(9)硝酸盐还原试验 接种细菌后在37℃培养4d,沿管壁加入磺胺酸冰醋酸溶液和α-萘胺乙醇溶液各2滴,出现红色为阳性反应,颜色不变为阴性反应。
(10)明胶液化试验 以接种针挑取培养纯化后的细菌,穿刺接种于明胶培养基中,在22℃下培养2~3d,每天观察结果。如室温在20℃以上时,培养2~3d后,可把培养物放入冰箱,然后取出观察,凡液化明胶者为阳性,不液化明胶者为阴性。
石蕊牛乳不变色,不产酸产气,不产生吲哚,VP试验和甲基红试验阴性,能还原硝酸盐为亚硝酸盐,不利用枸橼酸盐,触酶试验、氧化酶试验阳性,产生尿素酶,不使凝胶液化者初鉴定为布鲁氏菌,再进行进一步的分子生物学鉴定和血清学鉴定。
4.3 免疫学诊断
4.3.1 试管凝集试验(SAT)
SAT是我国布鲁氏菌病诊断的法定正式试验,因SAT检测IgM敏感性较高,故可用于布鲁氏菌病的早期诊断,同时可用于人、畜布鲁氏菌菌苗免疫后机体最早出现血清学抗体的检测。根据«动物布鲁氏菌病诊断技术»(GB/T18646—2018),其操作步骤如下:
(1)受检血清的稀释 在96孔U形聚苯乙烯反应板的第1孔加184μL稀释液,第2孔至第4孔各加入100μL稀释液;用微量移液器取受检羊血清16μL加入第1孔,并充分混匀;从第1孔吸取100μL混合液加入第2孔充分混匀,如此倍比稀释至第4孔,从第4孔弃去混合液100μL,稀释完毕后,从第1孔至第4孔的羊血清稀释度分别为1∶12.5、1∶25、1∶50和1∶100。牛血清稀释法与上述基本一致,差异是第1孔加192μL稀释液和8μL受检牛血清,其稀释度分别为1∶25、1∶50、1∶100和1∶200。
(2)取商品化试管凝集试验抗原按说明书要求稀释,分别取该抗原100μL加入上述各孔稀释好的血清中,并振荡混匀,羊的血清稀释度则依次变为1∶25、1∶50、1∶100和1∶200,牛的血清稀释度则依次变为1:50、1:100、1∶200和1∶400。
(3)将加完样的聚苯乙烯反应板各孔用塑料薄膜严密封盖后,放湿盒内置温箱(37℃±1℃)孵育18~24h,取出检查并记录结果。
(4)每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照,即:
①阴性血清对照:冻干阴性血清按说明书稀释到规定容量后,对照试验中稀释和加抗原的方法与受检血清相同。
②阳性血清对照:冻干阳性血清按说明书稀释到规定容量后,对照试验中稀释和加抗原的方法与受检血清相同。
③抗原对照:抗原按说明书稀释到规定容量,取100μL,再加100μL稀释液,观察抗原是否有自凝现象。
(5)凝集反应程度凝集反应程度分为5个等级,分别记为“++++”“+++”“++”“+”和“-”,按以下说明判定:
①++++:菌体完全凝集,1~4孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底。
②+++:菌体几乎完全凝集:1~3孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底,第4孔孔底呈现白色点状。
③++:菌体凝集显著,1~2孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底,3~4孔孔底呈现白色点状。
④+:凝集物有沉淀,第1孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底,2~4孔孔底呈现白色点状。
⑤-:无凝集,1~4孔孔底呈现白色点状。

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