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动物源性食品中细菌的检测——布鲁氏菌
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（5）尿素酶试验 在尿素细菌鉴定管中接种细菌，12～24h后观察颜色变化。尿素培养基变为红色为阳性反应，培养基颜色不变者为阴性反应。 （6）氧化酶试验 在白色洁净的滤纸上蘸取菌落少许，滴加1%四甲基对苯二胺水溶液，呈现玫瑰红色或深紫色为阳性反应，未出现颜色变化的为阴性反应。 （7）触酶试验 在灭菌的平皿上加数滴3%过氧化氢，挑取细菌并涂布在过氧化氢中，观察变化。有大量气泡产生为阳性反应，不产生气泡为阴性反应。 （8）吲哚试验 UIM培养管中先加1mL乙醚，充分振荡再沿管壁缓慢加入对位二甲氨基苯甲醛5～10滴，观察颜色变化。在培养物与试剂交接面上，呈红色者为吲哚试验阳性反应，无变化者为吲哚试验阴性反应。 （9）硝酸盐还原试验 接种细菌后在37℃培养4d，沿管壁加入磺胺酸冰醋酸溶液和α-萘胺乙醇溶液各2滴，出现红色为阳性反应，颜色不变为阴性反应。 （10）明胶液化试验 以接种针挑取培养纯化后的细菌，穿刺接种于明胶培养基中，在22℃下培养2～3d，每天观察结果。如室温在20℃以上时，培养2～3d后，可把培养物放入冰箱，然后取出观察，凡液化明胶者为阳性，不液化明胶者为阴性。 石蕊牛乳不变色，不产酸产气，不产生吲哚，VP试验和甲基红试验阴性，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，不利用枸橼酸盐，触酶试验、氧化酶试验阳性，产生尿素酶，不使凝胶液化者初鉴定为布鲁氏菌，再进行进一步的分子生物学鉴定和血清学鉴定。 4.3 免疫学诊断 4.3.1 试管凝集试验（SAT） SAT是我国布鲁氏菌病诊断的法定正式试验，因SAT检测IgM敏感性较高，故可用于布鲁氏菌病的早期诊断，同时可用于人、畜布鲁氏菌菌苗免疫后机体最早出现血清学抗体的检测。根据«动物布鲁氏菌病诊断技术»（GB/T18646—2018），其操作步骤如下： （1）受检血清的稀释 在96孔U形聚苯乙烯反应板的第1孔加184μL稀释液，第2孔至第4孔各加入100μL稀释液；用微量移液器取受检羊血清16μL加入第1孔，并充分混匀；从第1孔吸取100μL混合液加入第2孔充分混匀，如此倍比稀释至第4孔，从第4孔弃去混合液100μL，稀释完毕后，从第1孔至第4孔的羊血清稀释度分别为1∶12.5、1∶25、1∶50和1∶100。牛血清稀释法与上述基本一致，差异是第1孔加192μL稀释液和8μL受检牛血清，其稀释度分别为1∶25、1∶50、1∶100和1∶200。 （2）取商品化试管凝集试验抗原按说明书要求稀释，分别取该抗原100μL加入上述各孔稀释好的血清中，并振荡混匀，羊的血清稀释度则依次变为1∶25、1∶50、1∶100和1∶200，牛的血清稀释度则依次变为1：50、1：100、1∶200和1∶400。 （3）将加完样的聚苯乙烯反应板各孔用塑料薄膜严密封盖后，放湿盒内置温箱（37℃±1℃）孵育18～24h，取出检查并记录结果。 （4）每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即： ①阴性血清对照：冻干阴性血清按说明书稀释到规定容量后，对照试验中稀释和加抗原的方法与受检血清相同。 ②阳性血清对照：冻干阳性血清按说明书稀释到规定容量后，对照试验中稀释和加抗原的方法与受检血清相同。 ③抗原对照：抗原按说明书稀释到规定容量，取100μL，再加100μL稀释液，观察抗原是否有自凝现象。 （5）凝集反应程度凝集反应程度分为5个等级，分别记为“＋＋＋＋”“＋＋＋”“＋＋”“＋”和“－”，按以下说明判定： ①＋＋＋＋：菌体完全凝集，1～4孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底。 ②＋＋＋：菌体几乎完全凝集：1～3孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，第4孔孔底呈现白色点状。 ③＋＋：菌体凝集显著，1～2孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，3～4孔孔底呈现白色点状。 ④＋：凝集物有沉淀，第1孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，2～4孔孔底呈现白色点状。 |
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