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动物源性食品中细菌的检测——布鲁氏菌

日期:07-04 作者:曲志娜,赵思俊等- 小 + 大

4 检测方法
4.1 染色检查
疑似布鲁氏菌病的病料以绒毛叶渗出液、胎儿的胃内容物、肺脏、脾脏、阴道分泌物或脓肿中的脓汁以及培养物制成抹片。除用革兰氏染色法染色外,还可以应用鉴别染色法进行染色。
4.1.1 改良Ziehl-Neelsen氏法
适用于做胎膜和流产胎儿内容物染色。流产数日内取阴道拭子制作抹片,也可用此法染色。具体步骤是:
(1)抹片晾干,在火焰上固定。
(2)用ZiehlGNeelsen氏石炭酸复红原液的1∶10稀释液染10~15min(原液为碱性复红1g,溶于10mL无水乙醇中,加入5%石炭酸溶液90mL)。
(3)水洗后,用0.5%乙酸脱色15~30s。
(4)充分水洗后,用1%美蓝复染20~60s。
(5)水洗、干燥、镜检。
镜检结果:布鲁氏菌被染成红色,背景为蓝色。
4.1.2 改良Koster氏法
(1)抹片自然干燥,用火焰固定。
(2)用新配制的番红和氢氧化钾混合液(番红饱和水溶液2份与1mol/L氢氧化钾5份混合)染1min。
(3)水洗后,用0.1%硫酸脱色10s(或在10~20s用0.1%硫酸处理两次)。
(4)水洗后,用1%美蓝复染3s。
镜检结果:布鲁氏菌呈橘红色,背景为蓝色。
4.2 分离培养鉴定
4.2.1 分离培养
布鲁氏菌在体内分布广泛,几乎从病畜的所有组织器官、血液、乳汁及流产病料(胎儿的胃内容物、肝、肺、脾、羊膜液、胎盘及阴道排出物)中均能分离到细菌。采集无杂菌感染的病料样品各两份,分别接种胰蛋白胨培养基培养;或者如果是有杂菌污染的病料样品,可用加有杆菌肽、放线菌酮、乙种多黏菌素的选择性培养基。一份在37℃温箱中需氧培养;另一份在37℃含5%~10%二氧化碳烛缸中培养,分别在第2、3、4、5天进行观察,以后每隔3~4d观察一次,共3周。若在37℃温箱中需氧连续培养未有细菌生长,在二氧化碳烛缸中培养长出淡蓝色、圆形、稍隆起、透明、细小、表面光滑、均质的革兰氏阴性球杆菌,用鉴别染色法进行染色,细菌被染为红色且菌形为球杆或短杆状,则进一步进行生化鉴定。
4.2.2 生化鉴定
(1)石蕊牛乳试验 将培养纯化后的细菌接种于石蕊牛乳培养基中,培养观察1周,石蕊牛乳培养基变成蓝色者为阳性反应,不变色者为阴性反应。
(2)甲基红试验 接种纯化的细菌于葡萄糖蛋白胨水培养基中,37℃培养3d后,加入甲基红试剂,观察颜色变化。呈红色者为甲基红试验阳性反应,呈黄色者为甲基红试验阴性反应。
(3)VP试验 将细菌接种于该培养液中,37℃培养3d后,依次加入6%α萘酚酒精溶液0.6mL和40%氢氧化钾水溶液0.2mL,充分振荡,观察结果。在数分钟内出现红色者为维培二氏试验阳性,颜色不变为维培二氏试验阴性。
(4)枸橼酸盐利用试验 在枸橼酸盐细菌鉴定管中接种细菌,24~48h后观察培养基颜色变化和菌落生长情况。如果有菌落生长,培养基从绿色转变为蓝色,则为阳性;阴性则不见有细菌生长,培养基仍为绿色。

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