基础兽医
猪瘟诊断技术的应用进展
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三、 分子生物学检测 （一）定性检测技术 1. RT-PCR技术。用RT-PCR技术检测猪瘟病毒在国内外使用的比较普遍。吴鑫等设计了1对针对猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物，能从接种猪瘟F114毒的PK-15细胞总RNA中扩增出目的片段。用建立的RT-PCR方法检测26份疑似猪瘟病料，结果检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%。巢式PCR技术是在RT-PCR基础上，用第二套引物扩增第一次反应生成的PCR产物的亚片段，可使检测结果更具有特异性。魏淑英用建立的巢式PCR对山东某规模化猪场中临床上疑似猪瘟病例的组织进行检测，用一扩引物在305 bp处扩增出目的条带，二扩引物在172 bp处扩增出更加明显的目的条带，确诊为猪瘟病毒感染。胡建和等设计了2对分别针对猪瘟强毒株和HCLV的特异性引物。根据3，端引物碱基错配对PCR扩增效率的影响，优化筛选出了能够鉴别HCLV和强毒株的PCR退火温度，经多重试验组合建立了一套鉴别猪瘟强弱毒的多重RT-PCR方法。 2.LAMP检测技术。环介导等温扩增技术（LAMP）是一种在等温条件下，依赖于自动循环的链置换技术，需要针对靶序列上的6个区域设计4条引物，该方法特异性强，灵敏度高，不需要PCR仪，操作简单方便，目前已成为研究的热点。陈蕾等提取猪瘟石门血毒(103.84TCID50)RNA做101-108倍梯度稀释，进行RT-LAMP灵敏度试验，结果RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高100倍。Hao tai Chen等针对CSFV的5，-UTR保守序列设计了4条引物，建立了CSFV的RT-LAMP检测方法。该方法不能从PCV2（猪圆环病毒2型）、PPV（猪细小病毒）、 PRV（猪伪狂犬病毒）、 PRRSV（猪蓝耳病病毒）、JEV（日本乙型脑炎病毒)的核酸中扩增出目的片段，能从CSFV-GS 和 CSFV-LT株核酸中扩增出阳性片段。用RT-LAMP对临床样品血液、扁桃体、鼻腔或直肠分泌物进行检测，检出率分别为100%, 83% 和 72%，表明检测血液和扁桃体的灵敏度要高一些。 （二）定量检测技术 1.实时荧光定量PCR技术（FQ-PCR）。实时荧光定量PCR技术（FQ-PCR技术）在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到了广泛应用。Risatti等用荧光定量RT-PCR对实验感染猪鼻拭子、扁桃体和全血进行了检测，发现该方法的敏感性超过病毒分离，达到1～100 TCID50。赵建军等设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对CSFV石门系强毒株和HCLV的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分CSF强弱毒株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的CSF强毒株与HCLV完全区分开来，且不与其他猪源病毒发生非特异性反应。 王荣等建立了检测猪瘟病毒的 SYBR Green I 实时定量PCR 方法。SYBR Green I 是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料，与双链DNA 结合后，其荧光大大增强，且其荧光强度的增加与双链DNA的数量成正比。用该方法检测临床疑似病料，结果表明，建立的HCV SYBR Green I PCR方法特异性强，与FMDV（口蹄疫病毒）、PCV2、PRRSV、PPV、PRV 等常见猪病病原没有交*反应；灵敏度高，可以检测到5.3 ×102 的病毒拷贝数；操作简单，耗时短，只需3 h 即可完成整个试验过程。 2.PCR-ELISA。PCR-ELISA是用免疫学方法检测PCR产物，即在PCR扩增后，在微量板上借用ELISA的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。其原理是在进行PCR扩增时一个引物的5，端标记生物素，另一引物则在5，端标记显色基团（如FITC，用HRP标记的抗FITC结合显色），这样PCR产物就可结合到亲和素包被的塑料板上，靶序列被捕获。再在微孔中加入用HRP标记的抗体，抗体与靶序列上的抗原结合，再加入底物使之显色，可进行常规ELISA检测，设计已知标准对照，可进行定量。其过程为：核酸的提取与制备；PCR扩增；微孔预杂交；PCR产物杂交；显色反应；检测分析。该方法的敏感性可与放射性核素标记相比，但又避免了核素的危险。 四、结 语 我国猪瘟诊断的方法虽多，但是各种技术均存在不同程度的缺点，各方法之间的相关性研究较少，相关方法标准化的制定也十分薄弱。因此，加强猪瘟强弱毒株鉴别检测技术的研究，加强开展抗原、抗体相关检测方法标准化的制定是今后猪瘟检测技术研究的趋势。另外，在猪瘟疫苗的生产过程中，疫苗病毒滴度的确定及其效力检验仍采用兔体测毒法，该方法耗时费力，且兔体个体差异大，无法准确对活体病毒量进行准确标定，因此开发新的方法来替代兔体测毒法也是今后研究的一个方向。 |
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