基础兽医

猪瘟诊断技术的应用进展

日期:03-23 作者:阳光畜牧网- 小 + 大


    三、 分子生物学检测
    (一)定性检测技术
    1. RT-PCR技术。用RT-PCR技术检测猪瘟病毒在国内外使用的比较普遍。吴鑫等设计了1对针对猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物,能从接种猪瘟F114毒的PK-15细胞总RNA中扩增出目的片段。用建立的RT-PCR方法检测26份疑似猪瘟病料,结果检出阳性病料24份,阳性检出率为92.3%。巢式PCR技术是在RT-PCR基础上,用第二套引物扩增第一次反应生成的PCR产物的亚片段,可使检测结果更具有特异性。魏淑英用建立的巢式PCR对山东某规模化猪场中临床上疑似猪瘟病例的组织进行检测,用一扩引物在305 bp处扩增出目的条带,二扩引物在172 bp处扩增出更加明显的目的条带,确诊为猪瘟病毒感染。胡建和等设计了2对分别针对猪瘟强毒株和HCLV的特异性引物。根据3,端引物碱基错配对PCR扩增效率的影响,优化筛选出了能够鉴别HCLV和强毒株的PCR退火温度,经多重试验组合建立了一套鉴别猪瘟强弱毒的多重RT-PCR方法。
    2.LAMP检测技术。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种在等温条件下,依赖于自动循环的链置换技术,需要针对靶序列上的6个区域设计4条引物,该方法特异性强,灵敏度高,不需要PCR仪,操作简单方便,目前已成为研究的热点。陈蕾等提取猪瘟石门血毒(103.84TCID50)RNA做101-108倍梯度稀释,进行RT-LAMP灵敏度试验,结果RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高100倍。Hao tai Chen等针对CSFV的5,-UTR保守序列设计了4条引物,建立了CSFV的RT-LAMP检测方法。该方法不能从PCV2(猪圆环病毒2型)、PPV(猪细小病毒)、 PRV(猪伪狂犬病毒)、 PRRSV(猪蓝耳病病毒)、JEV(日本乙型脑炎病毒)的核酸中扩增出目的片段,能从CSFV-GS 和 CSFV-LT株核酸中扩增出阳性片段。用RT-LAMP对临床样品血液、扁桃体、鼻腔或直肠分泌物进行检测,检出率分别为100%, 83% 和 72%,表明检测血液和扁桃体的灵敏度要高一些。
    (二)定量检测技术
    1.实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)。实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR技术)在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到了广泛应用。Risatti等用荧光定量RT-PCR对实验感染猪鼻拭子、扁桃体和全血进行了检测,发现该方法的敏感性超过病毒分离,达到1~100 TCID50。赵建军等设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对CSFV石门系强毒株和HCLV的特异性TaqMan水解探针,建立了一种能区分CSF强弱毒株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的CSF强毒株与HCLV完全区分开来,且不与其他猪源病毒发生非特异性反应。
    王荣等建立了检测猪瘟病毒的 SYBR Green I 实时定量PCR 方法。SYBR Green I 是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料,与双链DNA 结合后,其荧光大大增强,且其荧光强度的增加与双链DNA的数量成正比。用该方法检测临床疑似病料,结果表明,建立的HCV SYBR Green I PCR方法特异性强,与FMDV(口蹄疫病毒)、PCV2、PRRSV、PPV、PRV 等常见猪病病原没有交*反应;灵敏度高,可以检测到5.3 ×102 的病毒拷贝数;操作简单,耗时短,只需3 h 即可完成整个试验过程。
    2.PCR-ELISA。PCR-ELISA是用免疫学方法检测PCR产物,即在PCR扩增后,在微量板上借用ELISA的原理,使用酶标抗体,进行固相杂交来实现定量。其原理是在进行PCR扩增时一个引物的5,端标记生物素,另一引物则在5,端标记显色基团(如FITC,用HRP标记的抗FITC结合显色),这样PCR产物就可结合到亲和素包被的塑料板上,靶序列被捕获。再在微孔中加入用HRP标记的抗体,抗体与靶序列上的抗原结合,再加入底物使之显色,可进行常规ELISA检测,设计已知标准对照,可进行定量。其过程为:核酸的提取与制备;PCR扩增;微孔预杂交;PCR产物杂交;显色反应;检测分析。该方法的敏感性可与放射性核素标记相比,但又避免了核素的危险。
    四、结 语
    我国猪瘟诊断的方法虽多,但是各种技术均存在不同程度的缺点,各方法之间的相关性研究较少,相关方法标准化的制定也十分薄弱。因此,加强猪瘟强弱毒株鉴别检测技术的研究,加强开展抗原、抗体相关检测方法标准化的制定是今后猪瘟检测技术研究的趋势。另外,在猪瘟疫苗的生产过程中,疫苗病毒滴度的确定及其效力检验仍采用兔体测毒法,该方法耗时费力,且兔体个体差异大,无法准确对活体病毒量进行准确标定,因此开发新的方法来替代兔体测毒法也是今后研究的一个方向。

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