预防兽医
口蹄疫灭活疫苗研究进展
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在南美洲的某些国家和地区，只允许选用由泛美口蹄疫中心(PANAFTOSA：Centro Panamericano de Fiebre Aftosa)推荐的疫苗毒株，例如O1 Lcampos已经成功应用了几十年。 2.1.2 病毒生产 应用于商品疫苗大规模生产FMDV抗原的技术有3种：①牛舌上皮组织生产的Frenkel培养法；②在转瓶单层BHK-21传代细胞上生产的单层培养法；③在发酵罐中BHK-21或IFFA8传代细胞上(后者仅在法国梅里厄病毒研究所应用)生产的悬浮培养法。这三个大规模病毒抗原生产系统，虽然各有利弊，但都能生产出高质量的病毒抗原用于疫苗制造。转瓶培养系统的核心是采用摇动或转动的圆筒培养容器，能使细胞交替接触培养液和空气，从而使传质和传热比固定培养要好，但是其表面积有限，单位体积所提供的细胞生长表面积小，细胞生长密度低；悬浮培养法是应用密闭的大容量发酵罐系统培养细胞，当细胞数增至3×106个/mL时，即可接种病毒，并于接毒后20 h～30 h收毒，此时病毒滴度一般可达107～108 TCID50/mL[6]。 目前国际上以在发酵罐中BHK-21悬浮培养法生产病毒常用。所需的疫苗株被鉴定出来后，它们需要适应在BHK-21细胞悬浮培养中生长。然而，大部分FMDV对单层细胞的适应性比悬浮培养好得多。常用的方法是首先在BHK-21单层细胞上传代，当细胞能够快速(12 h内)发生病变时，这些毒株可以进一步适应悬浮培养的细胞，直到病毒复制到最佳。 2.2 灭活 病毒灭活和随后的安全试验是制备灭活FMD疫苗中最关键的步骤。欧洲一些口蹄疫的暴发与疫苗接种有关，表明疫苗中的病毒不一定总是被很好的灭活。甲醛多年来一直被用于灭活病毒，但其缺点是灭活过程不符合一级动力学原理(first order kinetics)。病毒液中的水解乳蛋白和Tris缓冲液能抑制甲醛的活性。所以，到20世纪80年代，大多数疫苗生产商改用氮丙啶类(aziridine)灭活剂[7]，如AEI(N-acetylethyleneimine)，灭活曲线为线性，主要作用于核酸，蛋白免疫抗原保持较好，但毒性较大。也有用BEA(bromoethylamine hydrobromide)的，该灭活剂毒性稍小，作用同AEI(binaryethyleneimine)。后来Bahnemann等对BEA进行了改进，即为BEI，作用同 AEI但毒性小，被广泛采用。2000年世界动物卫生组织(OIE)向各国推荐使用1 mmol/L BEI两次灭活法，即20 ℃～37 ℃灭活24 h后再加一次BEI，再灭活24 h的方法，此法已经过20多年的应用，证明其较好。2006年OIE又推荐3 mmol/L BEI两次灭活法，以26 ℃共灭活48 h[8]。BEI用量从1 mmol/L增加到3 mmol/L，灭活温度从30 ℃降至26 ℃，灭活剂用量的提高意味着疫苗的安全性会更好，温度的降低有利于保持病毒粒子146 S的完整性。 有研究表明，用aziridine灭活病毒与甲醛相比，不仅毒性大而且灭活的病毒稳定性差。用甲醛灭活的弗氏佐剂苗有效期可达10年，而BEI灭活的疫苗有效期不超过2年。甲醛的灭活稳定性可能与其交联性有关，不稳定的SAT2型用aziridine灭活后，再经甲醛处理，稳定性明显提高。而甲醛与BEI的协同作用可将灭活的效力提高100倍，缩短了灭活时间，既改善了疫苗的安全性，又保护了有效抗原146 S完整性[9]。 2.3 抗原浓缩纯化 FMD灭活疫苗诱发有效的免疫应答，通常需要较大量的抗原，而疫苗中的非病毒蛋白可引起变态反应，另外，伴随病毒增殖而产生的病毒非结构蛋白对于感染动物的甄别亦带来困难。因此，在灭活疫苗特别是多价苗生产中，为了保证免疫效果，降低疫苗使用剂量，减少接种引起的有害反应，利于病毒抗原和成品苗的贮存，便于免疫和感染的鉴别，就必须对病毒抗原进行浓缩纯化。现在常用于大规模生产的纯化浓缩方法是超滤和PEG或聚乙烯氧化物(PEO)沉淀法，不仅可以达到理想的浓缩倍数，还可大大降低抗原收获物中非病毒蛋白成分及含量。 用超滤法浓缩FMDV制备品的开拓者是Strohmaier。目前，在生产中用切向流超滤装置或中空纤维过滤系统或震动筛进行浓缩[8]。然而，过滤材料的载流量小于等于100 ku时纯化效果不好，而大于200 ku时146 S的损失又大[9]。 使用分子质量为6000(PEG 6M)的PEG(聚乙二醇)纯化时，能够充分的去除来源于BHK疫苗中引起过敏反应的物质。沉淀的抗原用低速离心法获得，也可用助滤剂进行沉淀抗原的过滤，如钙化的硅藻土，比离心法方便的多[10]。灭活抗原也能用PEO沉淀法有效的沉淀。PEG沉淀可充分除去变应原成分，PEO可使FMDV浓缩达1 000倍，从病毒收获物中最少除去95%的杂蛋白质。 |
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