非洲猪瘟的荧光定量PCR现场快速检测操作示范

一、样本裂解处理（样本处理区）

吸取核酸释放剂100μL于1.5mL离心管中，加入经前处理的组织匀浆上清，血清、血浆、全血，拭子浸泡液等样品20 μL，盖上管盖充分混匀，95℃加热处理10 min，然后12000 rpm离心1 min，取上清作为模板进行扩增。

1. 注意裂解上清应尽快进行后续实验。

2. 视频中有用猪警-2000或水浴锅进行热处理的方法，两种方法二选一。

二、反应体系的配置（试剂准备区）

根据待测样本、阴性对照以及阳性对照的数量，按比例（ASFV-反应液38 μL/头份+DNA 酶混合液2 μL/头份+ ASFV-内置参照0.5μL/头份）取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心。

1. 取出包装盒中的各组分（酶混合液除外），室温放置，待其回温融化。

2. 将包括酶混合液在内的各组分混匀后，瞬时离心备用，降低耗损。

三、样本加样

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量准备反应管，向每个反应管加入40 μL PCR-Mix，吸取已处理的样本DNA、阴性对照、阳性对照各10 μL加入对应反应管，盖好管盖，转移到扩增区。

先加阴性对照-封盖，然后加待测样本-封盖，最后加阳性对照，降低污染。

四、上机扩增

1. 打开软件：点击实验向导，进入基本设置，根据实验要求填写信息，控温方式勾选“fast控温”，其他默认；

2. 孔板编辑：勾选待测样本的反应孔，勾选“选择项目”中设置好的程序，同时勾选阴/阳性对照对应的反应孔，勾选“样本类型”做出对应选择。

3. 样品信息：对每份待测样本进行样品信息登记，点击“开始”，进行扩增实验。

注意：

1. 可以实时的在状态栏中对运行状态、温度、曲线等指标进行检查。

2. 45分钟即可完成扩增实验。

五、结果分析及报告

扩增实验完成后，界面会多出“实验分析”项，进入可对结果进行分析，可在“反应孔信息表”框中对样品的名称、检测项目、检测目标、Ct值、浓度、判定等指标进行显示，参数设置确定后，可对勾选的样本结果进行报告输出。

点击软件界面上方的 “实验表格”选项，会自动生成结果报告，点击“实验数据”选项，可导出具体的实验数据。