非洲猪瘟病毒可以通过饮水和饲料传播
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摘要：非洲猪瘟是一种具有传染性，快速传播的跨国界动物疾病，并主要威胁全球的生猪养殖企业。所有在饲料厂生产的饲料，都被认为有潜在的将该病毒传播到猪场的风险，但是非洲猪瘟病毒在饲料中传播的风险研究报道非常的少。本文的目的是为了研究ASFV格鲁吉亚2007株在通过自然饮水和摄食饲料的过程中，感染猪只所需要的最低和中等剂量病毒。非洲猪瘟病毒在饮水中的最低感染剂量为100 50%TCID50。在饲料中为104 TCID50。中等感染剂量在水中为101 TCID50，在饲料中为106.8 TCID50。 我们的研究报道证实ASFV格鲁吉亚2007株可以通过口腔传播，尽管在饲料厂生产的饲料中感染剂量相对要求较高，这些数据可以为研究非洲猪瘟传播的风险模型提供非常重要的信息。非洲猪瘟病毒是对于北美和欧洲生猪养殖企业的一个新威胁，在过去的20年里，非洲猪瘟病毒传播到了东欧和俄罗斯，近年来传播进入中国和比利时。非洲猪瘟感染后的特征是严重的全身性出血，并且报道得案例死亡率可以达到百分之百。该病毒属于非洲猪瘟属，并且是唯一已知的虫媒性的DNA病毒。 非洲猪瘟疾病控制的难点在于缺乏有效的疫苗，并且该病有可能在野猪和蜱之间地方性的流行。由于缺乏有效的疫苗以及治疗方法，在ASF阴性国家里，预防非洲猪瘟的传入成为首要任务。非洲猪瘟发生之后，对周边的猪只采用限制流动以及大规模扑杀感染猪只的策略。据估计，如果非洲猪瘟传播进入美国，损失将会大于40亿美元。 在历史事件上，包括2007年非洲猪瘟进入高加索地区，以及之后传入俄罗斯地区，都被证实是通过食用被污染的猪肉制品，或者直接与猪只接触造成的。在肉和血液中存在的非洲猪瘟病毒在室温下可以存在数月以上，并且对于温度和pH值有一定的抵抗力。分子研究显示，近来中国和西伯利亚发生的非洲猪瘟病毒，在基因型上都与格鲁吉亚2007株类似。这些报道的案例，猪群之间都相隔上千公里以外，例如，非洲猪瘟从沈阳到温州，至上海，在三周之内传播了将近2100km。最近罗马尼亚也有报道，非洲猪瘟在大型生物安全等级较高的猪场内发生。非洲猪瘟病毒是经由附近污染的河流进入该14万头种猪厂的。2013年美国发生的流行性腹泻，被证实是病毒经由污染的饲料，通过饲料运输车跨界将该病毒运送到了生物安全等级较高的大型猪场之内，这也被认为是一个非常高的风险。从猪流行性腹泻跨境传播的案例中，我们认识到饲料在传播疾病过程中扮演的风险角色。但是数据显示非洲猪瘟通过饲料传播的风险是有限的。 2014年非洲猪瘟进入拉脱维亚境内并且在该地区传播，被发现伴随着将病毒污染的新鲜草料喂给阴性猪只的行为。除此之外，近来的研究报道证实，非洲猪瘟病毒可以在饲料原料中存活，例如传统豆粕、有机豆粕、豆油，豆饼、胆碱等，并且通过跨太平洋航运从东欧运送往美国。这些报道提示非洲猪瘟的传播也有可能通过运输途径，例如饲料或者饮水的途径传播，但是这些被人们所知甚少。非洲猪瘟主要通过几个途径传播，包括肌肉注射传播，口鼻传播以及直接接触传播。在很多研究口鼻传播途径的实验中，非洲猪瘟病毒是直接注入口内或者扁桃体上。非洲猪瘟通过生产的饲料或者自然饮水过程感染所需要的感染剂量研究报道是缺失的。此外也没有格鲁吉亚2007株通过饲料传播的研究报道。尽管有田间报道经过饲料传播的案例，但是并没有报道关于成功感染的剂量。因此我们的研究目标是：第一，确定感染成功和剂量之间的关系；第二，确定非洲猪瘟成功使一头猪感染的最小或者最低剂量（MID）；第三，当猪只自由采食或者饮水时，确定能够使半数猪只感染非洲猪瘟格鲁吉亚2007株的半数感染量（ID50）。 一、材料和方法 1、非洲猪瘟病毒接种准备 我们分离并使用非洲猪瘟格鲁吉亚2007株作为本次实验研究的材料。病毒从感染的猪只脾脏内收集，将脾脏研磨后，使用添加青霉素和两性霉素B的PBS处理细胞，将材料于4000转离心30分钟，并于4℃保存。将材料用添加青霉素和两性霉素B的PBS再次悬浊，并且反复冻融三次获得病毒，将悬浊液离心后取上清于4℃保存。取3到5周龄大小的猪的肺泡巨噬细胞作为病毒滴定的材料，使用添加10%胎牛血清RPMI培养基培养肺泡巨噬细胞，于37℃ 5% CO2的孵化箱内孵育2天。将病毒按10的倍数进行倍比稀释，并且加入培养有肺泡巨噬细胞的96孔板中，37℃下培养3天，之后用80%的丙酮固定细胞十分钟，将p30单克隆抗体稀释1:6000后用于细胞染色，37℃孵育1小时，并且用PBS清洗3次，使用羊抗鼠抗体按1:400倍稀释，检测结合的抗体，37℃孵育1小时，使用荧光显微镜观察染色的细胞，并且计算每毫升log1050%组织感染量 （TCID50/mL）。最终我们从脾脏中分离出格鲁吉亚2007株，病毒含量从100 TCID50 到 108 TCID50，添加到每100mlRPMI培养基或者100g饲料中。饲料的基本配料是玉米和大豆，并且根据营养配方添加足够的营养物质，适合用于10-25kg仔猪，不含动物源性原料。将每10ml病毒加入100g饲料中，停留30s，然后手动拌匀。 |