非洲猪瘟防控及疫苗研发：挑战与对策
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2.1 对非洲猪瘟感染保护性免疫的认识 对ASFV感染引起的保护性免疫认识不清楚，是制约ASF疫苗研究的主要原因。ASFV基因组集成了抑制干扰素产生、抑制细胞凋亡和自噬等多种免疫逃避机制；编码了多种病毒蛋白参与调控宿主的免疫应答。早期曾认为，ASFV无法诱导产生中和抗体，随后发现p72、p54和p30蛋白具有中和作用，p72和p54可以抑制病毒的吸附，p30可以抑制病毒的内化[29]。ASFV抗体介导的中和作用可能与其他病毒不同，这种独特性可能是病毒在细胞传代过程中外膜成分发生改变，从而失去了中和特性；也可能是血清的存在封闭了抗体的中和活性[30]。ASFV的其他囊膜或者内膜蛋白，如CD2v、p12、D117L也可能诱导中和抗体参与抑制病毒的入侵和释放[29-30]。其中CD2v可以和细胞AP-1蛋白互作并参与病毒的细胞内转运，推测与病毒毒力和免疫逃避有关[31]。 特异性的CD8+ T细胞在抗ASFV感染中有着重要作用[32]。核酸疫苗在没有ASFV特异性抗体的情况下可以诱导产生部分保护，这与CD8+ T细胞应答有关[33]。利用DNA质粒文库鉴定出了多种具有潜在保护力的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) 抗原表位[34]。ASFV结构蛋白p30、p72可以激活CTL应答，但是是否具有保护作用还不清楚[35]。因为体内T细胞的异质性，使得具有保护作用的CTL表位的鉴定非常困难。除了CD8+ T细胞外，T细胞以及自然杀伤细胞 (NK细胞) 等在抗ASFV感染中都发挥了重要作用[34]。目前认为细胞免疫和体液免疫在抗ASFV感染中都具有重要作用[36]。 2.2 灭活疫苗 ASF灭活疫苗是最先开始尝试研究的，但是绝大部分无保护作用[37]。Blome等于2014年利用最新的佐剂PolygenTM/Emulsigen®-D和制备技术对ASF灭活疫苗进行了重新评估，免疫的猪只用强毒攻击后可产生ASFV特异性抗体，但很快出现了急性临床症状。因此，试验还未结束所有猪都被实施了安乐死[38]。值得注意的是，本研究为了模拟自然感染采用了较高的攻毒剂量 (109 TCID50/mL)。 灭活疫苗不能提供保护作用，可能与ASFV复杂的免疫机制有关，也可能与细胞内和细胞外两种不同成熟方式的感染性病毒颗粒有关。细胞内病毒颗粒是指在VF组装的ASFV，由基因组、内核心壳、内膜和衣壳组成，具有感染性；细胞外病毒颗粒是指在VF组装后通过出芽方式获得囊膜并释放到细胞外的病毒颗粒，也同样具有感染性。ASFV的囊膜含有CD2v、p12等病毒蛋白和一些细胞蛋白，而病毒的衣壳和内膜则含有50多种蛋白。细胞内病毒颗粒和细胞外病毒颗粒表面的蛋白差异巨大，这种差异可能导致这两种类型病毒颗粒的免疫原性不同，这可能是灭活疫苗不能提供免疫保护的原因之一[39]。 2.3 亚单位疫苗、核酸疫苗和病毒活载体疫苗 ASFV亚单位疫苗、核酸疫苗 (表1) 研究的思路是选择具有保护作用的抗原基因 (p72、p54、p30、D2v)，利用杆状病毒系统进行表达。使用p54和p30共同免疫猪只，可以提供部分的保护作用[40]。然而当使用p72、p54、p30共同免疫时却不能提供保护作用[41]。利用杆状病毒表达的CD2v可以诱导针对ASFV强毒株的部分保护[42]。这些抗原基因以及其他ASFV可能的抗原基因的DNA表达文库核酸疫苗也在研究之中，这些核酸疫苗免疫效果同亚单位疫苗相似，只能提供部分保护，有的甚至无保护[43-45]。 ASFV活病毒载体疫苗的研究，目前集中在诱导免疫应答方面。通过选用痘病毒、腺病毒、伪狂犬病病毒等载体表达ASFV保护性抗原基因 (p72、p54、p30、CD2v、p12、EP153R)，使用“鸡尾酒”式混合免疫或者加强免疫策略，结果发现，免疫猪只可以产生特异性抗体和CTL反应[46-48]。但这些研究还未涉及免疫保护试验，其保护效果有待进一步验证。亚单位、DNA疫苗虽然可以诱导ASFV特异性抗体及相应的细胞免疫反应，但是不能提供完全保护。 2.4 减毒活疫苗 西班牙和葡萄牙在ASF流行期间曾使用减毒活疫苗 (Live attenuated vaccines，LAV)，但免疫猪只出现了慢性感染和临床症状后被迫弃用[39]。随后从软蜱及慢性感染猪只体内分离到了一些天然弱毒株，如OURT88/3和NH/P68[39]，免疫后对同源毒株攻击完全保护，但由于免疫途径、免疫剂量、攻毒株的不同，保护率不等 (66%–100%)[49-51]。在Vero细胞上连续传110代而致弱的ASFV-G/V株不能提供有效保护[52]。全基因组测序结果发现，ASFV-G/V株基因组的末端出现大片段的基因缺失和部分基因的移码突变，这种突变可能是其适应Vero细胞的原因，却使ASFV-G/V的抗原性发生了改变，不足以诱导机体产生保护性免疫应答[52]。ASF减毒活疫苗具有毒株特异性，自然致弱和非靶细胞传代致弱的LAV免疫效果迥然不同。目前LAV存在的残余毒力、病毒血症、亚临床症状等安全性问题亟需解决。 |