非洲猪瘟防控综述

PCR, 聚合酶链式反应, 是体外扩增基因的一种方法。研究表明, 非洲猪瘟感染8h, 便可从血液中检测到其核酸物质, 因此, 针对非洲猪瘟病毒保守区域设计引物, 对采集的血液或组织病料等相关物质进行DNA提取, 进行PCR反应, 可对其进行快速准确诊断。荧光定量PCR, 通俗讲是PCR的升级版, 其更加敏感、准确。

3.4.1　 血清学检测方法

3.4.1.1　酶联免疫吸附试验 (ELISA)

ELISA应用于血清抗体的检测, 具有操作方便、特异性较好、灵敏度高的特点, 适用于大批量样品的检测, OIE将ELISA作为诊断ASF的首选血清学方法。ASFV含有约150种蛋白, 目前国内外常用作检测抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等。Wardly等 (1979) 首次建立了间接ELISA方法检测ASFV抗体, 具有较好的敏感性和特异性。Pastor等(1990) 分别以ASFV主要结构蛋白VP73和病毒感染的细胞培养物中高特异胞质可溶性抗原 (CS-P) 建立了两种间接ELISA方法, 两种方法特异性均较高, 但是CS-P抗原比VP73抗原至少能提前2d检测出ASFV抗体。Vidal等(1997) 用VP73单抗建立的固相ELISA, 能够检测到浓度为0.5μg/m L的VP73抗原和2.3×102pfu/m L的全病毒颗粒。Hutchings等(2006) 比较了用全病毒多抗血清和针对VP73蛋白的单抗进行间接夹心ELISA检测ASFV, 显示多抗血清的敏感性高于单抗。Perez等(2006) 以昆虫细胞表达的P30重组蛋白为包被抗原, 建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法, 敏感性高, 可用于ASFV特异性抗体的早期检测。Gallardo等(2009) 利用重组蛋白p K205R、p B602L、p104R和P54建立的ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性。蒋正军等 (2000) 以杆状病毒表达的ASFV VP72蛋白为抗原, 研究和组装了间接ELISA抗体检测试剂盒, 具有反应体系小、快速、特异等优点, 且比Dot-ELISA方法更加敏感。仇华磊 (2006) 采用大肠杆菌表达的GST-VP72融合蛋白为包被抗原, 建立了间接ELISA。朱红(2007) 成功获得5株分泌抗ASFV VP72蛋白单克隆抗体的细胞株, 也建立了间接ELISA方法。李秋霞 (2010) 以大肠杆菌表达的ASFV p ET32a-VP73L重组蛋白作为包被原, 也建立了间接ELISA方法。曾少灵等 (2013) 利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达的ASFV的VP73重组蛋白作为检测抗原, 建立了间接ELISA方法。靳雯雯 (2014) 以VP73纯化蛋白作为包被抗原, 建立了间接ELISA方法, 与商品化的阻断ELISA相比, 其具有较好的敏感性和特异性。董志珍等 (2012) 针对ASFV P54蛋白建立了单克隆抗体竞争法ELISA并构建了检测试剂盒, 灵敏度高于间接免疫荧光 (IFA) 方法。梁云浩等 (2014) 利用Bac-toBac杆状病毒表达系统表达出的ASFV P54重组蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法。邬旭龙等 (2016) 以原核表达的ASFV p K205R蛋白作为包被抗原, 建立了间接ELISA检测方法。张倩等 (2012) 采用瑞典Svanova ASFV间接ELISA抗体检测试剂盒对辽宁绥靖、内蒙古赤峰、大连东港共计92份猪血清进行了ASFV抗体的检测, 结果全部为阴性。邓飞等(2016) 采用西班牙Ingenasa ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒对来源于四川省内的92份猪血清进行检测, 结果表明, 92份血清样本均为ASFV抗体阴性。

3.4.1.2　胶体金免疫层析 (GICA) 试纸条

张鑫宇等 (2014) 用原核表达的ASFV P54重组蛋白制备了ASFV抗体快速检测胶体金试纸条, 通过对ASFV不同感染时期141份猪血清样品进行比对检测, 显示该试纸条在感染早期的符合率高于OIE推荐的ELISA检测方法。刘波(2014) 也运用原核表达系统和胶体金免疫层析技术, 对ASFV快速检测试纸条的技术进行了研究。吴海涛(2015) 运用双抗体夹心法原理纯化后的抗ASFV单克隆抗体制备金标抗体, 制备了用于检测ASFV的胶体金免疫层析试纸条。

3.4.1.3　其他血清学方法

荧光抗体试验 (FAT) 可用于检测野外可疑猪或实验室接种猪的脾、淋巴结等组织压片和冰冻切片中的ASFV抗原。该方法具有快速、经济、敏感性和特异性高等优点, 但需要专业试验人员, 同时需要荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体。因此仅作为ASFV的辅助检测方法。间接免疫荧光试验 (IFA) 可用于检测感染ASFV的猪血清样品。该方法的优点是当ELISA检测结果不确定或制备抗原困难或复杂时, 可选用此法。Malmquist等(1960) 提出并建立了血细胞吸附试验方法, 血细胞吸附是指猪的红细胞附着在感染ASFV的单核细胞或者巨噬细胞的表面。绝大多数从非洲分离的ASFV毒株以及最初从欧洲国家分离的ASFV毒株均产生猪红细胞吸附现象。Pan等 (1978) 应用免疫过氧化物酶噬斑染色技术, 对接种ASFV的Vero细胞进行检测, 3d后观察到噬斑。可对ASFV进行抗原定量分析。此方法快速、特异, 不用借助其他仪器, 肉眼便可观察结果。Pastor等 (1992) 用细胞质可溶性抗原CS-P, 建立了斑点免疫 (DIA) 检测方法, 敏感性与OIE推荐的ELISA方法相当。Marco等 (2007) 建立了免疫组化法, 用来检测急性感染ASFV猪的扁桃体组织病理学变化, 通过检测发现, 感染ASFV猪有出血、单核细胞增多现象。免疫组化法是通用的检测方法之一, 但对于临床症状不明显的病例, 确诊有一定难度, 因此, 该方法仅作为ASFV的辅助检测方法。

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