非洲猪瘟疫苗研究进展（一）
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编者按：非洲猪瘟（African Swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病。该病虽最早见报于1921年，但由于病毒基因组大，基因型多且非常容易变异等客观原因，造成至今无有效的疫苗面世。虽然如此，但国外ASF疫苗研发一直在开拓前行,而国内大多数文献只进行了简单的描述，没有全面展示ASF疫苗的研究进展，为此作者就ASF疫苗的相关研究进展进行综述，以期为我国ASF的疫苗研究提供参考。 ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属中的唯一成员，而且是唯一的虫媒DNA病毒。在1982年的国际病毒分类委员会第4次报告中因ASFV与虹彩病毒科的形态相似，将ASFV划分为虹彩病毒科。但随后发现其DNA结构和复制方式明显不同于虹彩病毒科内的其他成员而与痘病毒相似，故在1991年的国际病毒分类委员会第5次报告中将其划为痘病毒科内，但置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。进一步研究发现ASFV的复制策略与痘病毒也有差异，且具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，所以在2000年的国际病毒分类委员会第7次报告中将其归属于非洲猪瘟病毒科，而且是其中唯一的成员。ASFV颗粒直径约200nm，衣壳呈二十面体对称，具有复杂的多层结构。病毒基因组为一条线性双链DNA分子，长度在170-190 Kb之间，可编码约200种蛋白质。由于ASFV的抗感染机制十分复杂、基因型多（22个基因型）且病毒容易变异，故ASF疫苗一直未研究成功，但国外科学家一直在不断尝试。 1、灭活疫苗 灭活疫苗作为最经典的疫苗研制方式，在非洲猪瘟发现之后即已开始研发，但早期落后的灭活工艺无法取得满意的制苗效果。如经加热，复方碘溶液，甲苯，福尔马林，结晶紫，β-丙内酯，乙酰氮丙啶和缩水甘油醛处理的ASF灭活疫苗虽部分能刺激猪产生抗体但即使借助佐剂仍无法抵御ASFV的攻击。上世纪60年代后的研究也证实ASF灭活疫苗作用微弱或仅在某些病例中发挥部分保护作用，如用ASFV接种的肺泡巨噬细胞悬浮液制备的灭活疫苗免疫后无保护作用，ASFV感染猪的脾组织匀浆经弗氏完全佐剂乳化制备的灭活疫苗仅可以使ASF同源毒株的攻毒保护率达到70%且所有存活猪都表现出临床症状，该实验的第二次验证仍只能达到50%以上的保护率。由于灭活疫苗自身固有的缺陷,很难刺激先天免疫系统诱导产生高水平的细胞免疫，而随着ASF研究的不断深入，科学家逐渐认识到细胞免疫对于ASFV感染的重要作用，因此科学家又希望通过添加佐剂或免疫增强剂来提高ASF灭活疫苗的功效，刺激机体产生合适的细胞免疫反应。但最新的研究结果证实，即使使用最新的佐剂，如PolygenTM或Emulsigen?-D等，ASF灭活疫苗仍无法达到有效保护的目的。 2、弱毒疫苗 早在1957年，科学家即认识到感染了低毒力存活下来的猪可以抵御同基因型强毒株的攻击。随后，在上世纪60年代，大量的试验证实ASFV经细胞多次传代培养后可以使其毒力下降，接种家猪不再产生致死性感染，这使得人们相信制备ASF弱毒疫苗的可能性很大。1963年，Manso-Ribeiro等证实通过猪骨髓细胞传代致弱的ASF弱毒疫苗可以抵御强毒株攻击。此弱毒疫苗随后在葡萄牙和西班牙进行田间试验，但却造成了灾难性的后果。免疫后的许多猪出现了肺炎，运动障碍，皮肤溃疡，流产和死亡等疫苗免疫副作用。特别是在葡萄牙，550,000只猪免疫后有128,684只出现免疫副作用，且出现大量病毒携带猪。据推测，随后出现的ASF疫情中分离的弱毒株可能也来自此次疫苗接种。这种现象也与SANCHEZ BoTIJA等的实验室攻毒结果相似，后者证实ASF弱毒疫苗接种后，即使没有接种强毒株，大多数的免疫动物仍会出现慢性感染且最终死亡率达到10%-50%。很多病毒携带者虽能在长时间内保持健康状态，但大多数最终发展为慢性肺炎或因急性发作而死亡。最终的死亡率与弱毒返强的程度，试验动物的敏感程度和接种动物的压力状况等有密切关系。有实验发现，当ASF弱毒疫苗接种猪暴露于口蹄疫、牛瘟或猪瘟的环境压力下时，相比较无此压力的ASF弱毒疫苗接种猪，在面对强毒攻击时暴露在压力之下的猪更易死亡。 由于此次失败的临床经验，ASF再无弱毒疫苗进行过田间试验。虽然ASF弱毒疫苗的田间试验停滞不前，但是关于此方向的研究仍在继续。通过自然筛选或细胞传代致弱技术，Ruiz-Gonzalvo F等（1981年，1986年），Leitao等（2001年），Boinas等（2004年）和King等（2011年）均证实ASF弱毒疫苗可以抵御强毒株的攻击。为进一步研究ASFV致弱的分子机制，Linda K. Dixon等对葡萄牙分离的基因I型自然弱毒株OURT88/3进行了全基因测序，经与西非强毒株Benin 97/1和西班牙Vero细胞传代适应株BA71V对比分析后发现，OURT88/3和BA71V均出现了8-10Kbp片段大小的基因丢失。这个片段可以表达5个拷贝的多基因家族（multigene family，MGF）360和2个拷贝的多基因家族505/530。这2个多基因家族的丢失可以增加I 型干扰素的产生和增强干扰素的反应强度。OURT88/3同时还在EP402R和EP153R基因处发生移码突变，这2个基因表达的蛋白经证实也与免疫逃避有关。这些基因的丢失和中断可能在ASFV致弱或增强机体免疫水平方面发挥重要作用。 |