基础兽医
禽坦布苏病毒（黄病毒）研究进展
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4.3 荧光定量RT-PCR 荧光定量PCR技术将光谱技术融合至PCR扩增反应中，实现了PCR扩增反应的实时跟踪和定量检测。Yan等根据ATMUVE基因序列设计引物与探针，建立的检测ATMUV的荧光定量RT-PCR方法的灵敏度比常规RT-PCR方法高100倍，检测常见禽病病毒均为阴性。Yun等建立的检测ATMUV的荧光定量RT-PCR方法，包括核酸的提取过程在内，2h内即可完成。高凤等建立的ATMUV荧光定量RT-PCR方法对鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、腺病毒、鸭瘟病毒、猪乙脑病毒的检测均为阴性，与病毒分离鉴定的符合率高达100%。荧光定量RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、全封闭反应、耗时短等优点，但该方法所需试剂与仪器均较昂贵，且对操作人员要求较高，限制了其在基层及一般实验室的普遍应用，但省级以上重点实验室可采用该方法进行ATMUV的定量检测与快速诊断。4.4 RT-LAMP 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）无需特殊仪器设备、肉眼判读、操作简单、特别适合基层兽医部门应用。 Wang等建立的可视化检测ATMUV的RT-LAMP方法在63℃水浴50min内即可完成扩增，敏感性达2拷贝/μL。Tang等建立的ATMUVRT-LAMP方法灵敏度达45拷贝/μL，检测常见10种禽病病毒均为阴性。李兆龙等建立的ATMUVRT-LAMP方法在常规水浴锅中45min内即可完成，灵敏度达1pg，比常规RT-PCR方法高100倍。RT-LAMP方法本质是一种核酸扩增检测方法，故具有极高的敏感性与特异性，且该方法简便、快速、无需特殊仪器设备，特别适合基层兽医部门使用，具有广阔的应用前景。 4.5 血清学抗体检测 检测抗体可以了解群体ATMUV的感染情况，为制定合理的防制措施提供参考。姬希文等建立的ATMUV间接ELISA方法检测常见禽病病原阳性血清均为阴性，批内和批间重复试验的变异系数分别小于2.9%和3.9%，应用该方法与琼脂扩散试验同时检测140份血清样品，间接ELISA检测出阳性108份，琼扩试验检测出阳性32份。但该方法以纯化的全病毒作为诊断抗原，存在散毒的潜在危险，故利用基因工程方法获得病毒保护性抗原逐渐得到发展和重视，郝明飞等以原核表达的重组E蛋白为诊断抗原，建立了检测ATMUV抗体的间接ELISA方法。Li等以ATMUVE蛋白单克隆抗体为阻断抗体，建立了检测ATMUV抗体的液相阻断ELISA方法，该方法与鸡胚中和试验方法的符合率高达70.6%。血清学抗体检测方法高通量、操作简单、检测快速、特异性强、敏感性高，可以作为ATMUV的快速诊断与流行病学调查的一种有效方法。 5 疫苗 5.1 灭活疫苗 万春和等制备的ATMUV油乳剂灭活疫苗具有良好的安全性、无毒副作用，能够有效保护ATMUV野毒的攻击。李振华等也制备了ATMUV灭活油乳苗，将10日龄雏鸭分成4组，分别免疫PBS、0.2mL、0.5mL和0.8mL疫苗，并于免疫后28d攻毒。结果显示，0.5mL组抗体水平及T淋巴细胞数量与对照组相比差异均极显著（P<0.01），0.2mL组免疫功毒保护率为80%，0.5mL和0.8mL组免疫功毒保护率均为100%，而PBS对照组雏鸭均表现为典型的ATMUV感染症状，其中3只死亡。ATMUVD灭活疫苗具有良好的安全性和免疫保护效果，为ATMUVD灭活疫苗的研制开发与推广应用提供了参考依据。灭活疫苗作为最经典的疫苗，具有易保存、有效期长等优点，但灭活疫苗免疫剂量较大，且只产生体液免疫，产生的免疫力较低，免疫持续时间较短。因ATMUVD为新发病，故灭活疫苗成为能够最快实现产业化生产的疫苗。 5.2 基因工程疫苗 E蛋白是坦布苏病毒的囊膜蛋白，具有良好的免疫原性，是ATMUV主要的保护性抗原，且参与病毒的细胞膜融合和穿入，与病毒的致病性密切相关。徐大伟等将ATMUVE基因克隆于真核表达载体pCAGGS中，构建了编码E基因的真核表达重组质粒pCAGGS-E，将pCAGGS-E尾静脉注射免疫BALB/c小鼠，间接ELISA检测表明随着免疫次数的增加及免疫时间的延长，小鼠的抗体滴度逐渐升高。该研究表明构建的ATMUVE基因核酸疫苗免疫小鼠后，能够激发小鼠产生高水平的抗体，但该疫苗对鸭的免疫效力需进一步验证。基因工程疫苗是在现代免疫学、生物化学、分子生物学等基础上研制成功的新型疫苗，能同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，具有安全、高效、廉价、多价等优点，其潜在的应用价值不可估量，但目前只是在研究阶段，距规模化生产和产业化应用还有很长的一段时间。 6 结语 ATMUVD自2010年4月份在我国首次暴发后，研究学者反应迅速，在短短3年的时间里对该病的病原学、病理学、流行病学、诊断技术、疫苗等方面的研究均取得了突破性进展，明确了ATMUV的生物学特性与遗传变异规律，阐明了其病理学变化特征以及流行特点与规律，建立诸多分子生物学与血清学诊断方法，研制了灭活疫苗和基因工程疫苗。下一步的研究重点将是加强ATMUV结构蛋白与非结构蛋白的特征与功能性研究、致病机理、跨物种传播机制等基础性研究，同时应利用反向遗传操作技术构建感染性克隆和研制新型弱毒疫苗，加强诊断技术与灭活疫苗的推广与临床应用等。随着研究学者的不断努力，AT⁃MUV的基因组学、致病机理、传播机制、新型疫苗与诊断试剂等研究必将日趋成熟和完善，从而为我国ATMUVD的预防和控制提供更加合理的科学依据。 |
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