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陈文庆 王建超 刘华杰 高飞 张韧
（北京清大天一科技有限公司 102200） 【摘要】采用反应器全悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒与微载体悬浮培养Vero细胞生产狂犬病毒分别与相应的转瓶培养工艺生产案例对比分析，比较悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的生产效益。分析显示，与转瓶培养工艺相比，反应器悬浮培养工艺获得的细胞密度、病毒效价、产品的产量和质量明显提高，生产时的能耗和劳动力需求明显降低。结果表明悬浮培养工艺的生产效益明显高于转瓶培养工艺，适宜于国内生物制品工业化生产的升级换代。
【关键词】 细胞培养；生物反应器；悬浮培养；微载体
细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法。根据细胞是否贴壁，又分为全悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体培养。国际上该项技术发展较快，已趋向成熟，是疫苗、抗体等生物制品生产的普遍生产工艺模式。与转瓶培养技术相比，该工艺具有操作简单、产率高、容易放大等优点，本文结合口蹄疫病毒和狂犬病毒的生产，分别对细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的经济效益等进行了分析和分析。
1、全悬浮培养口蹄疫病毒与转瓶培养案例对比
高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主，早在1962年Capstick PB等就实现FMDV的悬浮培养[1]。1965年Telling, R.C.等实现在不锈钢发酵罐中悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗[2]。目前国外（Intervet公司、Merial公司）普遍已经采用2000~5000L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗。本文就本公司自主研发的650L生物反应器和无血清培养基进行悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗与转瓶培养工艺进行比较和分析。
1.1主要材料
细胞株：BHK21贴壁细胞株（中国兽医药品监察所）
毒 株：FMDV-O型（某兽用疫苗企业）
培养基：低血清MEM培养基(产品代号MD611)、BHK21细胞无血清培养基 （北京清大天一科技有限公司）
血 清：特级新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）
仪 器：5L反应器（德国贝朗），120L和650L CLAVORUS®生物反应器（北京清大天一科技有限公司）
1.2实验方法
1.2.1 转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒
将复苏的BHK21细胞在T75培养瓶中使用低血清培养基（含5％牛血清）培养，连续传代扩增接种15L转瓶，37℃培养48小时，传代比例为1:8-1:10，按常规方法接种病毒及维持液，细胞病变90%左右收获病毒液。
1.2.2 反应器全悬浮无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒
（1）贴壁细胞悬浮驯化培养：用BHK21细胞无血清培养基在恒温摇床或者方瓶中无血清驯化贴壁BHK21细胞，可采用直接驯化或者逐级降低血清驯化等方法，每代观察细胞数量和细胞活率，直至BHK21细胞在无血清培养基中的生长增殖速率正常，细胞活率达95%以上，并可连续稳定传代，说明细胞已适应无血清悬浮培养。
（2）反应器用种子细胞扩增：采用反应器罐倒罐逐级放大技术，细胞从摇瓶→5L反应器→120L反应器→650L反应器进行逐级放大培养。细胞培养方式为批培养，控制反应器各参数在正常范围：温度37.0℃、pH7.2~7.4、溶氧（DO）20~70%、搅拌转速50~150r/min。
（3）反应器培养口蹄疫病毒：待650L反应器中细胞达到一定密度，提高培养pH至7.5左右，按一定比例直接接种口蹄疫病毒进行病毒维持培养，控制温度、pH、DO、搅拌转速等参数在合适范围，在线无菌间隔取样判断细胞病变情况并检测病毒毒价（LD50, TCID50），确定收获的最佳时间。
1.3 细胞培养结果对比
分别对低血清培养基15L转瓶培养的贴壁BHK21细胞进行观察和细胞计数，反应器全悬浮培养的BHK21细胞取样进行数量和活率检测。
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