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1. 4 从细胞水平和分子生物学水平证实猪瘟持续感染对机体的影响
1. 4. 1 猪瘟病毒 E0 基因对持续感染的影响 经研究证实, 猪瘟病毒的囊膜糖蛋白E0基因位于病毒粒子的表面, 对病毒的免疫、识别、吸附并进入宿主细胞是十分重要的。在猪瘟病毒感染的细胞中,E0蛋白是惟一可以分泌到猪瘟病毒浸染的细胞培养上清液中的糖蛋白。并可诱导机体产生中和抗体, 用 E0 免疫猪可诱导产生对致死剂量的保护性免疫反应, 同时也是病毒粒子吸附进入易感细胞的必须蛋白。在病毒粒子中, E0以分子量为 100 kD 的同源二聚体的形式存在, 但糖蛋白E0并不像E2那样具有跨膜区, 而是以一种未知机制连接在病毒粒子的表面上, 对猪瘟病毒在细胞中的复制、表达和调控过程中起重要作用。糖蛋白 E0 既是一种包膜糖蛋白, 又是一种核酸酶, 已有研究发现, 猪瘟 E0 基因含有与地衣类及植物核酸酶同样保守的两个氨基酸基序 SLHGIWPG( 或 E) ( 28～36位) 和 EWNKHGWC( 75～82 位) , 基序中位于 30 和79 位的 H( 组氨酸) 为 RNase 的催化活性关键氨基酸残基, 高度保守,E0蛋白的这种RNase活性已分别被试验所证实。值得注意的是,E0蛋白的RNase活性似乎与宿主细胞凋亡有关, 重组 E0 蛋白能够在体外诱导多个物种的淋巴细胞凋亡。
近年来 Hulst 等通过对 C 株基因组全长 cDNA中的 E0 基因中的关键氨基酸残基 H 进行突变, 获得了无E 0 RNase活性的病毒突变体, 表明该两区域中的 H 对 RNase 活性是不可缺少的。同时还发现由此突变株建立的无 RNase 活性的突变株能导致 SK-6细胞出现细胞病变效应(CP E) ,而这种RNase活性失活的猪瘟病毒将变成一种致病性病毒粒子, 导致细胞凋亡。推测 E0 蛋白的RNase 活性可能对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系, 而且在病毒复制过程中有可能发挥了重要作用。同时提示E0 在毒株演化中对于病毒适应宿主细胞也可能具有重要作用, 也可以E0为靶蛋白来设计新的抗病毒策略。由此推测基因在猪瘟病毒持续感染、细胞嗜性等方面发挥重要作用。
1. 4. 2 猪瘟病毒对细胞的持续感染 利用田间分离鉴定的造成怀孕母猪与仔猪持续感染的猪瘟病毒株( CSF V39、CSF V22) 分别接种 PK15 细胞, 体外连续带毒传代。建立了稳定的猪瘟病毒持续感染细胞模型, 获得 CSFV39-PK15 和 CSFV22-PK15 病毒持续感染细胞株。用免疫荧光技术、RT -PCR技术、透射电镜跟踪监测了CSFV 39-PK15 CSFV22-PK15持续感染细胞株连续传代过程中病毒在细胞内的存在情况。结果表明CSFV39-PK15细胞连续传至 127代, CSFV22-PK15 连续传至 57 代仍有猪瘟病毒存在, 表现为病毒对细胞持续感染的基本特征。在传代过程中, 成熟病毒可以释放到细胞外, 其相对感染量比感染原液至少低 2 个数量级。实验还表明: 猪瘟病毒可持续感染 PK15 细胞并使受感染细胞正常代谢机制发生明显改善, 即持续感染的猪瘟病毒随PK15 细胞的生长繁殖而增殖, 且从被感染细胞正常代谢所需的供能物质中获得病毒复制和转录所需的能量, 从而干扰了细胞固有的生理生化过程, 使细胞的正常代谢速率减慢, 形成了细胞代谢热功率变小及相同时段内被感染细胞代谢总热量降低等病理生理现象。此项研究为在细胞水平上研究猪瘟病毒的持续感染机理奠定了基础, 同时也为研究国内温和型猪瘟的发病机理提供材料, 具有理论意义和使用价值。
疫苗接种产生的中和抗体在体外对不同野毒株的中和作用表现出了很大差异, 耐受性高的毒株在血清 4 倍稀释时才能中和, 耐受性低的毒株用 320 倍稀释的抗血清就能将其中和。如果在体内也是这样, 那么在机体处于亚免疫状态的情况下, 耐受性强的毒株就有可能侵入机体潜伏下来造成持续感染。另外, 机体的免疫状态低下也可能是造成持续感染发生的重要原因。
2 疫苗方面的因素
2. 1 猪瘟兔化弱毒疫苗的免疫效力试验 针对目前国内对于我国 C 株弱毒疫苗的疑问也作了一些试验研究, 在实验室采用非免疫猪和无猪瘟病原及抗体存在的猪进行免疫保护相关性试验, 通过试验研究发现我国疫苗株对我国目前流行的不同毒力( 高、中、低) 、不同地域、不同分离时间以及不同基因亚群的多个野毒进行单独、混合、交叉、一次及多次攻毒, 均能获得完全保护。说明我国现用的猪瘟弱毒疫苗对目前流行的猪瘟野毒仍然有效, 初步证明现用疫苗的免疫原性没有发生改变。另外法国用我国C株和T hiv erv al对慢性猪瘟病毒引起的母猪繁殖障碍均有效, 日本的GPE 疫苗株也获得了同样的结果。
2. 2 猪瘟兔化弱毒疫苗的分子生物学研究
我们对国内生产猪瘟疫苗的厂家中随机抽取部分批次的猪
瘟细胞疫苗, 共( 18 个批次) 以进行免疫基因的分子生物学研究, 对这些疫苗的E2基因主要抗原编码序列分析表明: 所有批次疫苗的核苷酸及氨基酸均呈现较高的同源性, 均为 99. 1% ～100% ; 对 3 个厂家生产的猪瘟细胞疫苗的E0基因进行研究, 没有一个碱基发生变异, 其 E0 基因结构的稳定性均保持在较高水平, 表明国内所使用的疫苗株E0基因处于稳定状态, 并且其稳定性较E2基因高; 这初步说明目前我国国内生药厂生产的猪瘟兔化弱毒疫苗基本上是稳定的, 由此证明疫苗的种毒也没有发生变异。然而猪瘟病毒在细胞培养过程中繁殖滴度较低, 因此个别厂家猪瘟牛睾丸细胞苗存在滴度不够, 由此影响到疫苗的免疫剂量, 个别地区存在着由此引起的免疫失败的现象。
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