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牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法
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二、微生物方法 1 材料 1.1 菌株 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001购自国家医学菌种保藏管理中心，在营养琼脂上传代培养备用。 1.2 培养基 营养琼脂培养基、抗生素检测用培养基Ⅱ（低PH）购自陆桥。 1.3 试剂 试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水 1. 4 主要仪器 牛津杯（外径8mm） 2 方法 2.1 预试验 90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黄微球菌）。 2.1.2 生鲜牛乳抗生素分解剂活性分析 将10U青霉素药敏纸片均匀贴在抗生素检测用培养基表面，其中3片纸上滴加20ul不同稀释度的抗生素分解剂（500万U/ml，50万U/ml，5万U/ml），同时做生理盐水和青霉素药敏纸片对照。37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径。 将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。 2.1.3 青霉素G浓度的选择 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度（0IU/ml，0.005IU/ml，0.05IU/ml，0.5IU/ml，5IU/ml）青霉素G的生理盐水，37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径，以确定青霉素G使用浓度。 2.1.4 β-内酰胺酶对菌生长的影响 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度（0U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml，50万U/ml，75万U/ml，125万U/ml，250万U/ml）β-内酰胺酶的生理盐水，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。 2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。 将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。 2.1.6 脱脂奶对实验效果的影响 使用10%（w/v）脱脂奶代替生理盐水重复2.1.3、2.1.4、2.1.5实验。观察实验结果。 2.1.7 舒巴坦浓度的选择（未完成，实验参数待验证） 有实验表明，在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml舒巴坦进行测试发现，含有200ug/ml舒巴坦的脱脂奶在抗生素检测用培养基上不产生抑菌圈；含有25ug/ml舒巴坦可有效抑制10%脱脂奶中400U/mlβ-内酰胺酶对0.5ug/ml青霉素G的分解作用。 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。 在青霉素G浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G、400U/mlβ-内酰胺酶（高于推荐使用浓度100倍）和不同浓度舒巴坦（0ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察产生抑菌圈情况，以确定舒巴坦最终适用浓度。 |
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