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牛奶中的抗生素残留检测方法研究进展
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1.微生物检测法 微生物检测法是应用较广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用,来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留，如纸片法（PD）、TTC法、拭子法（STOP）等。采用传统的微生物检测方法，缺点是：(1)时间长；(2)显色状态判断通过肉眼辨别，易产生误差，对微红色者无法做出准确判断；(3)操作复杂。优点是费用低，一般实验室都能操作。其中， 纸片法和TTC法是牛奶中药物残留检测的两种常用的微生物检测法。 1.1纸片法 纸片法，即PD法(Paper Disc)。常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片检测法。这两种方法主要用来检测牛奶中的β－内酰胺类抗生素，其操作过程基本相同，而选用的菌种不同。枯草杆菌纸片法检测的结果易出现假阳性，为了确定阳性物质是否为青霉素（或β－内酰胺类），对加热后的乳样用青霉素酶处理，以灭活乳样中的青霉素。然后再行检测，检测限可达0.01 IU/mL。而嗜热脂肪杆菌纸片检测法不仅用于检测奶样中β－内酰胺类抗生素，并能暗示是否还存在其它抑菌物质，检测限可达0.008 IU/mL以下。一般在4h内即可获得结果。因此，在实践中嗜热脂肪杆菌纸片法比枯草杆菌纸片法应用更为广泛。此外，神保胜彦(1991)对纸片法作了进一步研究和改进。改进后的纸片法不仅能够确定抗生素的种类，而且提高了检出率和准确性，氯霉素最低检出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，链霉素1mg/kg，红霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。 1.2 TTC法 TTC法，即氯化三苯基四氮唑法( tripheye tetrazolium chloride)，是目前我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409—85)。该法简便、快速，无需特殊设备，3～4h可见报告，很适合牧场、乳品厂及食品卫生检测部门采用。检测各种抗生素所用的TTC法试验的灵敏度（最低检出量）分别为：青霉素0.004 U/mL，链霉素0.5 U/mL，庆大霉素0.4 U/mL，卡那霉素5 U/mL。 目前趋向研究更为灵敏、准确、简便、快速的微生物检测方法。如美国和加拿大，使用拭子法和牛的抗生素和磺胺实验法（CAST）。此外，美国近年来补充的一个新的实验方法－快速抗生素筛选法（FAST）。 尽管这些快速微生物检测法有时会产生一些假阳性，但在某种程度上是允许的；如产生这类情况，可进一步做确证实验。 2.理化检测法 理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、联用技术等等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，有的检测费用较高。在牛奶中抗生素残留检测方面，最常用的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。 2.1高效液相色谱 高效液相色谱(HPLC)是目前广泛应用的一种理化检测方法，它引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化。几乎所有的化合物包括高极性／离子型待测物和大分子物质，均可用HPLC进行测定。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细(ф 5～10μm)，需高压泵推动，柱效高(105塔板／m)，速度快，灵敏度与GC相近。与GC相比，HPLC流动相参与分离机制，其组成、比例和pH值等可灵活调节，如离子对色谱、胶束色谱、手性分离色谱等，使许多极难分离的待测物得以分析。反相HPLC发展最快，目前已成为大多数抗生素残留的常规分析方法。主要原因是：(1)化学键合固定相(C18或C8)性质稳定，不淋失；(2)使用水、甲醇或乙腈等水溶性有机溶剂作流动相，不干扰紫外检测，成本低；(3)样品中极性杂质先流出，只需待测物出峰后即可重复进样，分析速度快。 最常用的检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器。紫外检测器(UVD)最普及，其次是荧光检测器和电化学检测器(EChD)。由于奶样中药物残留量少，背景干扰往往很严重，因此一般都通过柱前衍生反应来提高紫外检测器检测残留的灵敏度。彭莉等报道了用高效液相色谱法（HPLC）检测牛奶中氯霉素的残留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中残留的氯霉素，用紫外检测器在278nm检测样品。平均加收率94.8％，变异系数< 12.0％。此方法样品前处理简单、回收率高、实用性强、检验灵敏度高、重现性好、检测数据准确可靠，可作为牛奶中氯霉素残留检测的确证方法。由于大部分抗生素在高于230nm的光谱区无吸收，而在低于230nm的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰，需衍生化后测定，限制了紫外检测器的应用。但是，大部分抗生素是手性分子，因此旋光检测器有很大发展潜力。旋光检测有以下特点：(1)选择性高，样本仅需简单提取即可；(2)灵敏度高，利用He－He激光作光源，灵敏度可达5～10uα水平；(3)可同时得到流出组分的比旋度[α]，用以定性。目前，该方法已用于红霉素、庆大霉素、羧苄青霉素和吩羧青霉素残留的测定。 此外，光二极管阵列检测器(DAD)是近10年来HPLC最重要的突破。DAD可同时接收整个光谱区的信息，在色谱峰流出同时能进行每个瞬间的动态光谱扫描并快速采集信号，经计算机处理后得到色谱—光谱的三维图谱，信息量大大增加。一次进样可得到每个组分峰的定量、定性和纯度信息，灵敏度亦明显提高。 |
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