基础兽医
中国猪瘟净化策略
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CSFV抗体标记技术有免疫荧光技术和过氧化物酶标记技术，也是OIE推荐的CSF病原检测技术之一。采用从英国VLA实验室引进的CSFVE2单抗WH303作为一抗，标记辣根过氧化酶的兔抗鼠二抗，建立了免疫过氧化物酶细胞单层试验染色方法，用于CSFVTCID50检测、病毒分离鉴定、拯救重组CSFV的鉴定及毒价测定，具有很好的特异性和稳定性。直接对单抗WH303进行荧光素标记，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应蛋白抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。我所和军事兽医研究所采用该单抗（WH303）分别建立了CSFV免疫荧光试验和CSFV间接免疫荧光试验，较多抗标记法更特异和准确，容易分辨，错判误判率会大大减少，田间推广应用容易，是CSF净化的一项准确、特异和简便的技术。 2.抗体检测技术 CSF抗体水平检测是疫苗免疫效果评价的主要方法，ELISA方法以其操作简便、敏感、检测样本量大等优点成为其主要手段。目前市场上众多的ELISA试剂盒，检测效果最好和最稳定的仍是进口试剂盒，尤其是idexx公司的CSF抗体检测试剂盒，因此研发国产化的准确度高的CSF抗体ELISA检测试剂盒势在必行。我们采用杆状病毒表达系统获得CSFVE2基因可溶性表达产物（专利受理书编号200810223406.0），突破了诊断用抗原的关键制备技术；对单抗WH303进行纯化和FITC标记。分别建立了CSF间接ELISA方法和阻断ELISA方法。抗体间接ELISA方法：采用中和实验作为金标准与间接ELISA对232个阳性样本和242个阴性样本进行符合实验，其敏感性符合率为90.95% ，特异性符合率为94.21%，两种方法的总符合率为92.62%。该方法具有操作简便，灵敏度高等特点，通过对血清中E2蛋白多抗的检测，可全面反应猪体内抗体水平，适用于田间大规模免疫抗体水平普查、商品猪场免疫效果评价和不同免疫水平猪群的分群。抗体阻断ELISA检测方法：对PRRSV、PRV、PCV、PPV、BVDV等病毒性疾病抗体（CSF抗体为阴性）无交叉反应。对285份临床血清样本的检测结果表明，与IDEXX试剂盒的特异性为94.2%，敏感性为98%。两种方法的符合性为97.5%。由于采用单抗WH303作为酶标抗体，大大了降低非特异性反应。通过与idexx试剂盒比较，两种试剂盒检测效果相近。该方法除用于田间大规模普查外，尤其适用于规模化种猪场和重点疫区抗体监测。制备成本较低，稳定性好，为我国CSF抗体水平的监测提供了重要的技术支持。 三、建立了猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法及疫苗中牛病毒性腹泻病毒检测方法的研究 猪瘟兔化弱毒株是世界公认的最安全、免疫效果最好的疫苗毒株，也是我国唯一使用的猪瘟疫苗毒株。家兔热反应是疫苗效价测定和成品效力检验的主要方法，难免检测结果准确性不佳，主要与实验动物个体差异和标准化程度不高、检测周期长有关，无疑提高了疫苗储藏成本，滞后了疫苗上市时间。必须对现有检测方法进行标准化研究，同时还必须采用新技术，建立新的准确简便的替代方法，提高疫苗检测质量，对其质量监控至关重要。我们建立了HCLV荧光定量PCR方法（HCLV-FQ-PCR），为疫苗兔热效检代替方法研究奠定了基础，能定量检测HCLV的病毒滴度，为疫苗效力检验提供了一种快速、敏感、特异的方法。同时还建立了CSFV单抗WH303直接免疫荧光检测方法，该方法特异性好，比荧光多克隆抗体更敏感，荧光背景值较低，更容易观察结果。对34份CSF疫苗同时进行兔热反应、HCLV-FQ-PCR检测、TCID50测定，发现三者之间存在良好的相关性，用HCLV-FQ-PCR及/或TCID50测定可以指导CSF疫苗的生产，对荧光定量CT值在17.10-20.81，病毒含量在8.27×104copy/μL-1.11×106copy/μL；或TCID50值在10-2.88/0.1ml-10-4.54/0.1ml之间的疫苗半成品原液，可以按半成品疫苗原液每毫升能引起100万个兔体定型热反应进行配苗。采用HCLV-FQ-PCR方法及CSF单克隆抗体直接免疫荧光方法测定疫苗生产中间产品的效价，代替传统的兔热反应方法，从而更准确、快速指导疫苗的生产，缩短疫苗生产周期，节约生产成本，产生更明显的经济和社会效益。 牛病毒性腹泻病毒也称牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease Virus，BDV-MDV），在分类学上属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属。国内外已有相关报道表明犊牛血清中存在BVDV污染，造成仔猪BVDV先天性感染，出现CSF类似症状与病变。所以在CSF细胞疫苗生产过程中，对原材料中BVDV检测是必不可少的。我们建立了BVDV-FQ-PCR方法，该方法只扩增BVDV，不扩增BVDV以外病原，与RT-PCR符合率为99.1％。通过对58份不同厂家不同批次的CSF疫苗半成品进行检测发现，污染率达20.7%；对不同厂家不同批次36份CSF成品检测发现污染率高达22.2%。具有快速、敏感、特异的特点，为CSF疫苗原材料BVDV污染检测提供了技术支持，保障CSF疫苗的质量。 四、猪瘟病毒致病机制及标记疫苗的研究 CSFV的3’UTR被认为与病毒基因组的复制、翻译以及复制和翻译的调控有关，序列比对发现猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的3’UTR核苷酸的第61位有一个12-nt（CUUUUUUCUUUU）的插入序列，这在强毒SM株以及其它毒株中是没有的。为研究这一特征性序列的生物学功能，特别是HCLV在减毒中是否发挥了重要作用，构建两个突变株感染性cDNA克隆，一株是在强毒SM株基因组pT7SM感染性cDNA克隆3’UTR的第61 位处插入了12个碱基“CTTTTTTCTTTT”，定名为pT7SM3’-+12；另一个是pT7SM的3’UTR完全被HCLV基因组3’UTR所替换，名为pT7SM3’-239。经拯救得到两株突变株病毒vT7SM3′-+12和vT7SM3′-239，分别在细胞和动物水平研究了突变株病毒的增殖特性和毒力变化情况。结果两个突变株在PK-15细胞上的病毒增殖滴度比其亲本株下降了约100倍；对实验用猪产生了明显减毒的现象，有效地诱导宿主产生中和抗体，并可以使宿主完全抵抗致死剂量的SM强毒的攻击，这种特性和HCLV十分类似。表明HCLV 3’UTR的 12个碱基插入对CSFV复制和毒力有着重要影响，与疫苗减毒有重要关系。该结果也提示CSFV的非编码区突变可以影响病毒的毒力，这对理解CSFV的减毒机理以及开发新一代疫苗提供理论依据。 |
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