良种繁育
牛胚胎移植过程中胚胎的采集和性别鉴定
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胚胎采集（冲胚）冲胚前的准备工作在供体牛输精后第7天，把冲胚的供体牛固定在床位上，对冲胚牛的外阴部用0.3%高锰酸钾进行清洗消毒，并在尾椎硬膜外腔注射2%盐酸利多卡因麻醉；将消毒后的采胚管用冲胚液冲洗，检查气囊是否完好，将无菌不锈钢导杆插入采胚管内。 冲胚方法操作者将手伸入直肠，检查两侧卵巢黄体数目。将采胚管经子宫颈缓缓插入一侧子宫角基部，由助手抽出部分不锈钢导杆，操作者继续向前推进采胚管，当到达子宫角大弯附近时，助手从进气口注入一定量的气体，认为气囊位置和空气量合适时抽出全部不锈钢导杆。助手用注射器吸取之前准备好的加温至37℃的冲胚液。从采胚管的进水口推进，进入子宫角内，再将冲胚液连同胚胎抽回注射器内，如此反复冲洗和回收6次。冲胚液的注入量由开始的30毫升逐渐加大到50毫升，将每次回收的冲胚液收入集胚器皿内，置于37℃无菌检胚室内等待检胚。一侧子宫角冲胚结束，按上述方法在冲洗另一侧子宫角，每侧子宫角用冲胚液500毫升。冲胚结束后，用土霉素针剂10毫升进行子宫内灌注消炎处理。 胚胎检查和级别鉴定冲出的胚胎要在立体显微镜下检查，从冲胚液中检出胚胎后快速放到培养液中。在室温为25℃的无菌操作室内进行操作，经过鉴定具有A、B级的胚胎再进行性别鉴定。 在100倍~200倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度与透明带的间隙以及变性情况等。 胚胎的性别鉴定胚胎取样将胚胎分割仪与倒置显微镜固定在一起，将一特制的显微分割刀固定在显微操作仪的操作手上，在直径60毫米分割平皿中做一个50微升的SPLIT-TING滴，每个胚胎在取样前先在SPLITTING液(分离液)中洗5遍，将洗好的胚胎放人其中。胚胎很容易粘到平皿底面，胚胎被放大100倍进行分割取样。理想的情况下，在桑椹胚的边缘或囊胚的滋养层切取由5个~6个细胞组成的小块。每个胚胎取样后，分割刀依次在纯水、95%乙醇、纯水SPLITTING液中洗涤。用2微升的移液枪装上2微升取样吸头，吸取2微升的回收液从分割液滴中将样品吸起，推入装有8微升超纯水的100微升离心管中。样品取走后，用200微升通用吸头吸取50微升回收液，从分割液滴中将取样后的胚胎吸起，放入6孔平皿对应的HOLDING液(保持液)滴中准备移植。 PCK反应在每个加有样品的离心管中依次加入8.5微升YCD（Y染色体检测，即引物），然后将其摆放在PCR反应槽。变性温度95℃，延伸温度72℃，退火温度64℃，经过30个循环65分钟进行DNA扩增。 电泳PCR扩增结束后，吸取5微升溴酚蓝对样品染色并点样，启动电泳仪。样品在130伏~140伏电压的琼脂糖凝胶板上运行15分钟~20分钟。 结果分析如样品只出现两条带，即雌雄共有的常染色体基因片段和“引物带”，即为雌性胚胎。 讨论性别鉴定胚胎移植技术是当前大力发展奶牛，尤其是发展高产奶牛的有利手段，也是取得好品种的有利措施。 性别鉴定胚胎是当今世界生物领域内高科技水平的体现，掌握了此项技术就是在生物技术领域占有了一席之地。本试验取得的成果是妊娠率56.8%，产母犊率96.6%，已经达到了世界先进水平。 |
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