猪瘟疫苗生产工艺资料综述

1、制苗用细胞

牛睾丸细胞或羊肾细胞。

2、生长培养液

目前的细胞培养液为乳汉（欧）液，或MEM＋10%新生牛血清+1%双抗（青/链霉素），pH7.0～7.2左右。

3、维持液

目前的维持液为乳汉（欧）液，或MEM＋2～5%新生牛血清+1%双抗（青/链霉素），pH7.4～7.6。

4、细胞生长良好的几个注意事项

1）制苗用细胞应选用非猪瘟疫区，无口蹄疫、粘膜病等传染病地区的1～4日龄健康小公牛或10日龄以内的健康羔羊。其家H健康生长的

2）培养基和血清的质量可靠、稳定。应确保无外源病毒、支原体、细菌等污染，无牛病毒性腹泻病毒（BVDV）及其抗体。用于生产猪瘟细胞苗的牛血清都要事先检测有无BVDV中和抗体的存在。

3）制备原代牛睾丸细胞时，防止细胞消化过度。

4）合适、营养丰富的细胞培养基。丰富的营养成分对细胞的生长、带毒状态维持和毒价的提高有直接影响。

5）转瓶的洗涤应遵循严格的清洗程序。转瓶洗涤不干净，容易导致细胞不贴壁生长。

生产用毒种有脾毒和细胞毒，脾毒是用选择定型热反应兔脾脏冷冻或冻干保存制备的；细胞毒是将用新鲜脾毒制成0.3%～0.5%的病毒悬液接种生长良好的牛睾丸细胞或羊肾单层细胞，取二收、三收的细胞培养液作为生产用毒种。脾毒应选择兔体反应在36小时之前，同时防止脾毒采集过程的污染。

该病毒不产生细胞病变效应(CPE)，可连续多次收液。取已形成良好单层的牛睾丸细胞（或羊肾细胞），弃去培养液，接种含3%～5%细胞毒种或0.2%～0.3%脾毒种的维持液。接毒后4或5日第一次收获换液，以后每4－6日收获换液1次，可连续12～15收左右，有的厂家可收更多。一般来说，12～15收前的毒价合格率高，疫苗质量好。接毒时，细胞生长状态的好坏影响细胞产毒。也可对细胞带毒分散，分散比率1：4左右，可增加收次和产量。

将检验合格的病毒培养液和5%蔗糖脱脂牛奶稳定剂按一定比例混合，分装，进行冻干。

1、猪瘟病毒（HCV）感染细胞超薄切片的电子显微镜观察表明，该病毒颗粒在膜结合的胞浆内空胞中装配并成熟，然后经胞外释放。

2、56℃处理60分钟或60℃10分钟可灭活细胞培养液中的HCV。HCV在pH5～10时稳定，pH5.2时最适宜生长，但在低于pH4或高于pH11时快速灭活。

3、猪瘟病毒的抗原性和血清学与牛粘膜/病毒性腹泻病毒(MD/BVDV)密切相关，两者同源性很高，能互相诱导一定程度的同源病毒抗体，细胞或培养液中若存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及其抗体，可与猪瘟病毒发生中和反应，造成疫苗生产的失败。

如果病毒收获液毒价不高，即病毒家兔感染量（RID）较低，制成的疫苗易造成免疫失败。猪瘟疫苗生产中毒价不高的可能原因：

1）细胞培养液（乳汉液）营养不足，尤其是使用高压灭菌液，高温可使一些营养成分损失，造成细胞生长状态不良；

2）细胞培养液较多存在外源病毒，尤其是牛病毒性腹泻病毒（BVDV）会直接造成病毒滴度降低；

3）成熟释放的病毒在维持液中耐受性较差，造成病毒滴度较低；

4）病毒毒种毒力较低，并在传代过程中弱化。

旧规程要求每1 ml病毒原液含病毒≥50,000个家兔感染量（RID）方可配苗，现要求提高至每1 ml含病毒≥500,000个家兔感染量。所以，提高疫苗单位毫升病毒量是提高疫苗质量的关键，进行猪瘟疫苗生产工艺的改进或者浓缩疫苗，显得非常必要、急迫。

【附】：用不同剂量的C株苗免疫猪，证实免疫剂量与保护水平密切相关。我国猪瘟细胞苗出厂检验以5万倍稀释能致兔体热反应为合格，即每毫升原液含5万RID。规定的免疫剂量为150RID（37PD₅₀）。剂量不足时，攻毒后不能阻止强毒在体内复制和带毒。免疫剂量提高到80～100PD₅₀（约320～400RID），攻毒后能制止亚临床感染，所有耐过猪均不带毒。目前欧洲为消灭HC亚临床感染，多采用加大免疫剂量的方法。欧洲药典规定用C株疫苗免疫时，肌肉注射剂量为100PD₅₀（400RID）。

1、使用化学成分明确的细胞培养基

化学成分明确的细胞培养基一方面能提供足够的营养，供细胞生长，同时避免动物来源成分（如由水解乳蛋白）带来外源病毒（如BVDV）及其抗体的污染。

2、使用低血清细胞培养基，减少血清使用量，提高细胞维持时间

清大天一有适合细胞培养生长的低血清MEM（MD611）细胞培养基，可使血清使用量减少50％左右，减少了外源因子污染的几率；并且由于该细胞培养基营养成分较传统细胞培养基丰富，可提高细胞活力水平，增加细胞维持时的营养供给。

3、使用改良的转瓶培养细胞

使用多层转瓶培养细胞可使单位体积溶液内的细胞数量增加，一方面提高了细胞密度，病毒增殖数量较大；另一方面也对病毒液进行了浓缩，提高了病毒原液的病毒量。

4、尽量减少水解乳蛋白的批间差，防止疫苗生产过程的不稳定情况。

5、使用质量保证的牛血清

血清是牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的主要来源，使用质量可靠、无外源病毒的血清可减少此类污染。

6、筛选、克隆较高毒力的毒种

使用营养成分丰富的细胞培养基筛选较高毒力的毒种，并用之做克隆毒种，制备具较高毒力的毒种。

7、使用病毒保护剂有资料显示，在细胞维持液中加入病毒耐热保护剂可减少无效病毒粒子的产生，提高病毒滴度。